产品目录

真菌是具有真核和细胞壁的异养生物，种属很多，已报道的属达1万以上，种超过10万个。真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。本试剂盒适用于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠处理，经过前期处理的菌液，用硅质膜吸附，即可得到高纯度的基因组。提取纯化后的DNA，可以直接用于PCR/Real-time PCR、Sequencing、Southern blot、Mutant analysis、SNP等下游应用。

• 对于大型真菌、蕈菌、蘑菇，本试剂盒提取效果会有所降低，不建议使用（附推荐处理方法）。
  
• 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签（每瓶需要单独添加45mL无水乙醇）。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
  
• 由于真菌种类万千，对于一些特别难处理的真菌，可用液氮研磨，再用玻璃珠振荡，蛋白酶K处理，一般都可以得到一定量的基因组DNA，如电泳检测很弱，一般PCR都会有较好结果。
  
• 若溶液A或溶液B中有沉淀，可在55℃水浴中重新溶解。
  
• 如果DNA提取量很少，可加长玻璃珠处理时间，如果提取DNA成弥散短条带，可减少玻璃珠处理时间。
  
• 洗脱缓冲液的体积最好不少于50μL，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

• 样品处理：
  
  • 对于酵母菌，取1～2mL培养好的菌液，离心收集，弃上清。加入200μL溶液A，加入2μL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5～10min。
    
  • 霉菌(孢子也可相同处理)：取50～100mg菌丝，加200μL溶液A，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入2μL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约30min。
    
  • 大型真菌（建议）：称取100～200mg样品，倒入适量的液氮，立即研磨重复3次，使样品研成粉末，加400μL的CTAB裂解液，加入2μL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5min，后续再采用本试剂盒继续提取。
• 加入20μL的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。
  
• 在上清中加入200μL溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。
  
• 再加入200μL无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2min。
  
• 12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
  
• 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50～200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
  
• 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。

得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。